Что такое элективные питательные среды? Классификация питательных сред и способы их приготовления Элективные питательные среды цель применения примеры.
Разработка питательных сред, и особенно плотных, для разных видов микроорганизмов позволила изучать их культуральные, биохимические, антигенные, вирулентные свойства.
Пастер для культивирования микробов использовал жидкие отвары. Первыми разработчиками плотных питательных сред были Кох и его ученики. Они первыми применили картофель, свернутую сыворотку, желатин, мясопептонный агар.
Плотные среды позволили получать чистую культуру микробов и изучать их свойства.
Стало возможным определять этиологические факторы многих инфекционных заболеваний, заняться созданием профилактических и лечебных препаратов.
Культивирование микробов на плотных питательных средах в лабораторных условиях позволило, получая чистые культуры, не только работать над созданием вакцин, диагностикумов, но и изучать спектр действия химиотерапевтических препаратов и антибиотиков, применяемых с лечебной целью, а также изучать действие химических препаратов, применяемых с целью профилактической, текущей и заключительной дезинфекции.
Постановка лабораторного диагноза связана с выяснением систематического положения микроорганизмов, полученных в чистой культуре (чистая культура – скопление микробов одного вида на питательной среде).
Получение чистой культуры часто является необходимым условием при изучении микроорганизмов, выделенных от больного.
Определение видовой принадлежности микроорганизмов включает определение целого ряда особенностей микроорганизмов: морфологии клетки, характера роста культуры на различных питательных средах, способности использовать те или иные химические соединения, отношения к температуре, рН среды, кислороду и пр. Кроме того, для определения вида у микроорганизмов часто необходимо знать продукты обмена веществ, антигенные свойства, нуклеотидный состав клеток, биохимическую активность, связанную с набором ферментов, и многое другое.
Определение всех этих признаков позволяет идентифицировать микроорганизмы.
Идентификация микроорганизмов очень важна при диагностике инфекций, установлении источников и путей передачи возбудителя.
Для того, чтобы можно было идентифицировать какой – либо микроорганизм, необходимо накопить особи в чистой культуре и в необходимом количестве.
Для выделения, культивирования, накопления и сохранения микроорганизмов пользуются питательными средами, содержащими все необходимые для микробов питательные вещества и имитирующими среду обитания микроорганизмов в естественных условиях.
Все питательные среды должны удовлетворять следующим требованиям:
1) наличие питательных веществ и факторов роста в легко усвояемой форме;
2) стерильность – отсутствие жизнеспособных микроорганизмов и спор;
3) изотоничность – одинаковое содержание минеральных солей внутри и вне клетки. Для патогенных микроорганизмов, адаптировавшихся к длительному пребыванию внутри организма человека, изотоничным считается 0,85% раствор хлорида натрия. Для микроорганизмов, обитающих, например, в океане (в соленой воде), изотоничность будет создаваться другой концентрацией солей, однако требование к изотоничности питательных сред остается;
4) оптимальное рН среды. Окислительно – восстановительный потенциал питательной среды создается ионами водорода, что способствует нормальному функционированию ферментов микроорганизмов;
5) прозрачность среды. Так как большинство бактерий одним из основных признаков роста на питательных средах является помутнение (на жидких средах – помутнение, осадок, пленка или смешанное; на плотных средах – образование колоний).
Важнейшей особенностью роста некоторых микроорганизмов на питательных средах: для лептоспир – отсутствие помутнения питательной среды (наблюдение за ростом и размножением этих микроорганизмов осуществляется при помощи фазово – контрастного микроскопа), для микоплазм и возбудителя туберкулеза – замедленный рост (помутнение или появление колоний не ранее чем через 21 сутки, а то и позже).
Питательные среды являются основой микробиологической работы и их качество нередко определяет результаты исследования. Поэтому при подборе сред следует учитывать как требования микробов в отношении веществ, необходимых для поддержания их жизнедеятельности, так и их возможность осуществлять в данных условиях обмен веществ между клеткой и средой.
Питательные среды должны создавать оптимальные (наилучшие) условия для жизнедеятельности микробов.
Чтобы осуществлять биосинтез, рост и размножение, клетка должна получать извне в необходимых количествах все содержащиеся в ней элементы и должна быть обеспечена источником энергии. В соответствии с тем, какие именно элементы доставляются клетке, вещества питательной среды называют источниками углерода, азота, фосфора, серы и т.д.
Соединения, в виде которых необходимые для конструктивных целей элементы должны быть внесены в среды, определяются синтетическими способностями микроорганизмов.
Форма источника энергии определяется способом ее получения.
Синтетические возможности микроорганизмов и способы получения ими энергии отличаются чрезвычайным разнообразием, поэтому и различны их потребности в источниках питания. Этот факт необходимо учитывать при составлении питательных сред, четко представляя, что универсальных сред, одинаково пригодных для роста всех без исключения микроорганизмов, не существует.
Таким образом, состав питательных сред определяется прежде всего особенностями, разнообразием обмена веществ микроорганизмов.
Необходимыми элементами питания микроорганизмов, как и других существ, являются углерод, азот, сера, фосфор, зольные элементы, а для многих микроорганизмов – различные дополнительные питательные вещества, такие как витамины, факторы роста и т.д.
Многие микроорганизмы, подобно высшим животным, помимо нормальных источников углерода, азота, минеральных солей и других элементов, служащих им источником энергии и материалом для синтеза, нуждаются еще в весьма существенных факторах роста. Особенностью факторов роста является их активность в чрезвычайно малых количествах.
Впервые фактор роста был обнаружен Вильде в 1901 году при культивировании дрожжей. Он заметил, что при засеве синтетической среды небольшим количеством дрожжей их роста не наблюдалось. Однако, если одновременно с посевом дрожжей в питательную среду внести дрожжи, убитые кипячением, рост появляется. Вильде объяснил это явление наличием в дрожжевой клетке некоторого фактора роста, названного им «БИОС».
Изучение природы БИОСа показало, что он представляет собой смесь нескольких компонентов. БИОС был расщеплен на две фракции «БИОС»-1 и «БИОС» -2. Обе фракции, взятые раздельно, не активны. Их способность стимулировать рост микробов проявляется только при совместном действии. «БИОС»-1 представляет собой инозит, «БИОС»-2 содержит гетероциклическое кольцо со свободной карбоксильной группой.
Вещества, аналогичные БИОСу, оказались необходимыми как факторы роста для многих микроорганизмов. Некоторые микроорганизмы нуждаются в добавлении к питательной среде витамина В.
По потребности в витамине В бактерии делятся на четыре группы:
а) бактерии, растущие на бульоне, лишенном витамина В. Эти бактерии не растут на синтетических средах (брюшнотифозная и дизентерийная палочки, гноеродный стафилококк);
б) бактерии, не нуждающиеся в экзогенном поступлении витамина В. Эти бактерии растут на безвитаминном бульоне и синтетических средах (кишечная палочка, холерный вибрион, синегнойная палочка, возбудитель сибирской язвы и др.). Микробы этой группы способны сами синтезировать витамин В;
в) бактерии, плохо растущие на безвитаминных средах (менингококк, возбудитель дифтерии);
г) бактерии, не растущие на безвитаминных средах (гемолитический стрептококк, пневмококк).
Установлено, что витамины группы В обладают способностью стимулировать рост и кислотообразование у пропионово – кислых и молочно – кислых бактерий.
Палочка инфлюэнцы, возбудители коклюша и мягкого шанкра нуждаются в факторе роста, состоящем из Х и Y факторов. Оба эти фактора находятся в крови, а также в картофеле и других растительных экстрактах.
Х – фактор термостабилен, он является гематином и может быть заменен некоторыми неорганическими соединениями железа, имеющими оксидную или каталазную активность. Гематин и другие соединениия железа необходимы для синтеза цитохромов, участвующих в процессах дыхания.
Y – фактор имеет витаминную природу, разрушается при автоклавировании, вырабатывается бактериями, дрожжами, клетками животных и растений.
Анаэробный микроб Bac. sporogenes использует в качестве фактора роста ненасыщенную жирную кислоту. ЕЕ наличие необходимо также и для роста Cl.botulinum и Cl. Perfringens. Это вещество образуется многими аэробными бактериями, например, брюшнотифозной, туберкулезной палочками, а также плесневыми грибами. Очевидно, это вещество необходимо для жизнедеятельности всех микроорганизмов, но анаэробные клостридии лишены способности сами его синтезировать.
Весьма активным фактором роста, имеющим универсальное биологическое распространение, является пантотеновая кислота. Амид никотиновой кислоты служит фактором роста для стафилококков. Без него стафилококки не растут на синтетических средах, содержащих гидролизованную желатину, триптофан, тирозин, цистин и глюкозу. Никотинамид синтезируется кишечной, брюшнотифозной палочками, а также холерным вибрионом.
К факторам роста относятся некоторые аминокислоты (необходимые для синтеза белка), пуриновые и пиримидиновые основания (идущие на построение нуклеиновых кислот) и др. Многие факторы роста входят в состав различных ферментов и играют роль катализаторов в биологических процессах. Вопрос о факторах бактериального роста весьма существенен. С одной стороны, он помогает понять физиологическую роль мясной воды, на которой готовятся лабораторные питательные среды для культивирования многих микроорганизмов. С другой стороны, разрешение вопроса о факторах роста позволяет более широко применять синтетические среды для культивирования микробов.
Питательные среды для одного и того же микроорганизма могут быть разными в зависимости от задач исследования. Например, среды, подходящие для длительного поддержания жизнедеятельности культур микроорганизмов, могут сильно отличаться от сред, предназначенных для получения тех или иных продуктов обмена, когда требуется стимулировать отдельные стороны жизнедеятельности микробов. Особые среды нужны для образования спор и других форм жизненного цикла.
По возможности питательные среды должны быть унифицированными, т. е. содержать постоянные количества отдельных ингредиентов. Для удобства слежения за ростом культур и контролем за загрязнением среды посторонними микроорганизмами питательные среды должны быть прозрачными.
По составу питательные среды подразделяются на натуральные, синтетические и полусинтетические.
Натуральными средами обычно называют среды, состоящие из продуктов животного или растительного происхождения, имеющие сложный неопределенный химический состав. Основой таких сред являются различные части зеленых растений, ткани животных, солод, дрожжи, фрукты, овощи, навоз, почва, вода морей, озер и минеральных источников. Большинство из них используются в виде экстрактов или настоев.
На натуральных средах хорошо развиваются многие микроорганизмы, так как в таких средах имеются, как правило, все компоненты, необходимые для роста и развития микробов. Однако среды с неопределенным составом мало пригодны для изучения физиологии обмена веществ микроорганизмов, поскольку они не позволяют учесть потребление ряда компонентов среды и выяснить, какие вещества образуются по ходу развития микроорганизмов.
Натуральные среды неопределенного состава используются, главным образом, для поддержания культур микроорганизмов, накопления их биомассы и для диагностических целей.
К числу сред неопределенного состава относят и так называемые полусинтетические среды. В их состав наряду с соединениями известной химической природы входят вещества и неопределенного состава. Такие среды находят особенно широкое применение в промышленной микробиологии для получения аминокислот, витаминов, антибиотиков и других важных продуктов жизнедеятельности микроорганизмов.
В качестве примера таких сред можно назвать мясо – пептонный бульон (МПБ), в состав которого одновременно с мясным экстрактом и пептоном, имеющими сложный состав, входят хлорид натрия, фосфорнокислый калий, а также иногда глюкоза или сахароза. К полусинтетическим относятся и картофельные среды с глюкозой и пептоном.
Синтетические среды – это такие среды, в состав которых входят только определенные, химически чистые соединения, взятые точно в указанных концентрациях.
Синтетические среды наиболее удобны для исследования обмена веществ микроорганизмов. Зная точный состав и количество входящих в среду компонентов, можно изучить их потребление и превращение в соответствующие продукты обмена.
Питательные среды бывают элективные, дифференциально – диагностические и консервирующие.
Элективные среды были введены в микробиологическую практику С.Н.Виноградским и М.Бейеринком. Это такие питательные среды, в которых путем добавления одного или нескольких химических соединений, создаются оптимальные условия для роста и размножения одного вида микроорганизмов (или группы родственных микроорганизмов) и неблагоприятные – для всех остальных. Такие среды применяются главным образом для выделения чистой культуры микроорганизмов из мест их естественного обитания и для накопления массы культур (химический метод выделения чистой культуры). Например, питательная среда, которая представляет собой свернутую лошадиную сыворотку, является элективной средой для дифтерийных бактерий, щелочная пептонная вода – для холерных вибрионов, желчный бульон – для возбудителя брюшного тифа, печеночный бульон – для бруцелл и т.д.
Накопление микробов а элективных питательных средах во многих случаях служит важным предварительным этапом при выделении чистых культур из исходных исследуемых материалов (например, холерного вибриона или брюшнотифозных бактерий из испражнений больных или носителей и пр.).
Дифференциально – диагностические среды – это такие среды, в состав которых кроме веществ, обеспечивающих рост и развитие микроорганизмов, входят вещества, применяющиеся в качестве субстрата для определенных ферментов. По качественному изменению субстрата Определяется присутствие того или иного фермента (оценивается при помощи индикатора, реагирующего на наличие в питательной среде продуктов распада субстрата).
Каждый вид микроорганизмов характеризуется достаточно стабильным набором ферментов. Определение набора ферментов при помощи дифференциально – дагностических сред позволяет дифференцировать виды микроорганизмов. Например, кровяной агар позволяет выявить фермент гемолизин, среды Гиса – сахаролитические ферменты (карбогидразы), желатин используется для учета протеолитических свойств микробов и т.д.
Кровяной агар. О наличии фермента гемолизина судят по разрушению эритроцитов и образованию светлой зоны вокруг микробов, выросших на кровяном агаре.
Среды Гиса. О наличии ферментов – карбогидраз, расщепляющих углеводы до кислоты, свидетельствует изменение рН среды в кислую сторону и изменение цвета питательной среды. Различие в наборе ферментов может быть использовано для проверки чистоты выделяемой культуры, а также для быстрой дифференцировки одного вида от других при первичном исследовании посевов заразного материала.
Консервирующие среды предназначены для первичного посева и транспортировки исследуемого материала. В них предотвращается гибель патогенных микроорганизмов и подавляется развитие сапрофитов. В качестве примера можно назвать глицериновую смесь, используемую для сбора испражнений при исследованиях, проводимых с целью обнаружения некоторых видов бактерий.
По физическому состоянию среды разделяются на жидкие, плотные, полужидкие и сыпучие. Для выяснения физиолого – биохимических особенностей микроорганизмов, а также для накопления их биомассы или продуктов обмена наиболее удобно применять жидкие среды. Плотные среды используются для выделения чистых культур, получения изолированных колоний, для хранения культуры и количественного учета микроорганизмов, определения их антагонистических свойств и в ряде других случаев. Полужидкие питательные среды, как правило, используются для более длительного хранения микробных культур. Для уплотнения сред применяют агар – агар, желатин и кремнекислый гель.
В промышленной микробиологии применяют так называемые сыпучие питательные среды. К таким средам относятся, например, разваренное пшено, отруби, пропитанные питательным раствором и пр.
Питательные среды бывают простые и сложные. К числу простых жидких питательных сред относятся пептонная вода, мясо – пептонный бульон (МПБ). К плотным простым питательным средам принадлежат мясо – пептонный агар (МПА) и мясо – пептонный желатин.
Простые питательные среды, особенно МПБ и МПА, служат основой для изготовления из них более сложных сред путем добавления к ним различных веществ, повышающих питательную ценность субстрата. Например, при добавлении глюкозы получают сахарный бульон или сахарный агар; асцит – агар и асцит – бульон получают при добавлении асцитической жидкости; цельная кровь является составной частью кровяного агара и кровяного бульона, а при добавлении сыворотки крови получают сывороточные среды (агар или бульон).
Среды более сложного состава обычно предназначаются для культивирования требовательных к питательному субстрату микробов, не размножающихся на простых средах. К таким микроорганизмам относятся возбудители гонореи, дифтерии, бруцеллеза, туляремии, сифилиса, возвратного тифа, риносклеромы, туберкулеза и др.
Питательные среды классифицируют в зависимости от исходных компонентов, консистенции, целевого назначения, химического состава.
В зависимости от химического состава и исходных компонентов различают следующие типы питательных сред.
Среды неопределенного химического состава. Их подразделяют на: 1) среды животного происхождения (исходные продукты - мясо, рыба, яйца, молоко и т.д.); 2) среды растительного происхождения (исходные продукты - соя, горох, картофель, морковь и т.д.).
Некоторые продукты используют в натуральном виде (картофель, морковь, молоко и т. д.), но чаще животные и растительные ткани подвергают различной обработке (экстрагированию, ферментативному или кислотному гидролизу).
Среды известного химического состава (синтетические). В них входят известные химические соединения (соли, углеводы, аминокислоты, витамины и т. д.) в оптимальном количественном соотношении. Синтетические питательные среды используют, когда выращиваемую клеточную массу необходимо максимально освободить от балластных органических соединений, входящих в состав обычных сред, например при получении диагностических аллергенов или при изучении метаболических потребностей микроорганизма в том или ином конкретном химическом соединении.
По консистенции питательные среды дифференцируют на плотные, полужидкие и жидкие.
Жидкие питательные среды. Готовят, используя экстракты, гидролизаты, растворы исходных продуктов.
Полужидкие и плотные питательные среды . Необходимую консистенцию среде придают добавлением различных уплотнителей.
Агар-агар (малайское желе) - полисахарид, продукт переработки некоторых морских водорослей. Плавится при 80...86 ºС, затвердевает при 40 ºС. Для получения плотных сред его добавляют в количестве 1,5...2%, реже 3 %; полужидких - 0,3...0,7%.
Желатина - экстракт из тканей, содержащих много коллагена (кости, хрящи, сухожилия и т.д.). Желатиновый гель плавится при 25 °С, что делает его неудобным для выращивания микроорганизмов с температурным оптимумом 37...38 °С. Кроме того, ряд бактерий выделяют протеолитические ферменты, разлагающие желатину. Обычно в питательные среды вносят 10...20 % желатины.
По целевому назначению различают общеупотребительные (основные), обогащенные, специальные, элективные (избирательные) и дифференциально-диагностические питательные среды.
Общеупотребительные (основные) среды . Их применяют для культивирования относительно неприхотливых микроорганизмов.
В качестве исходных компонентов для приготовления основных сред используют наиболее часто мясную воду, перевар Хоттингера, растительные гидролизаты.
Мясная вода: говядину освобождают от костей, жира, сухожилий, пропускают через мясорубку. Мясной фарш заливают водопроводной водой в соотношении 1: 2, кипятят 1 ч. После кипячения мясную воду охлаждают, фильтруют через ватно-мар-левый фильтр, затем доливают водопроводной водой до первоначального объема, разливают по емкостям, закрывают ватно-мар-левыми пробками и стерилизуют при 120 °С 20 мин.
Перевар Хоттингера готовят из мясных отходов путем их триптического гидролиза. Жир, фасции, сухожилия мелко нарезают, заливают кипящей водой в соотношении 1:2, кипятят, охлаждают до 45 °С и добавляют панкреатин, подщелачивают раствором карбоната натрия до рН 7,8...8,0, встряхивают и добавляют хлороформ (10 мл/л), плотно закрывают, выдерживают в теплом месте 10 дней, получают продукт гидролиза (перевар).
Мясо-пептонный бульон (МПБ). К 1 л мясной воды добавляют 1 % пептона и 0,5 % хлорида натрия, устанавли-
Рис. 32. Приготовление скошенного агара
вают необходимый рН дробным добавлением 10%-го раствора гидроксида натрия или гидроксида калия. Фильтруют через бумажный фильтр, разливают по колбам, пробиркам и стерилизуют при 120 "С 15...20 мин.
Мясо-пептонный агар (МПА): к МПБ добавляют 2...3 % промытого мелко нарезанного агар-агара, нагревают до расплавления агара, доводят до кипения, в горячем виде проверяют рН, затем, если необходимо, доводят его до нужного значения (7,2...7,6), фильтруют через ватно-марлевый фильтр. Профильтрованный горячий агар разливают по пробиркам и колбам, стерилизуют автоклавированием при 1 атм 20...30 мин. Чтобы получить скошенную поверхность агара, удобную для посева, после стерилизации пробирки с расплавленным МПА оставляют при комнатной температуре до уплотнения в наклонном положении (конец с пробкой приподнят) (рис. 32).
Широко используют культивирование микроорганизмов на плотных питательных средах в чашках Петри. Диаметр стандартной чашки Петри (рис. 33) около 10 см, выпускают чашки меньшего и большего диаметров, а также одноразовые пластиковые. В
стандартные стерильные чашки Петри над пламенем горелки наливают около 20 мл расплавленного и охлажденного до 45...50 "С питательного агара, чашки помещают на горизонтальную поверхность до застывания агара.
Полужидкий мясо-пептонный агар (ПЖА) готовят, как МПА, но добавляют 0,25 % агара. Кипятят при помешивании до полного расплавления агара, устанавливают рН 7,2...7,6, фильтруют в горячем виде, стерилизуют в автоклаве.
Мясо-пептонная желатина (МПЖ): к МПБ добавляют 10...20% измельченной желатины, нагревают до расплавления уплотнителя, устанавливают рН 7,2...7,4, кипятят, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, разливают по пробиркам и стерилизуют дробно в аппарате Коха три дня по 20 мин или однократно в автоклаве при 112°С 15 мин.
Бульон Хоттингера: основной перевар Хоттингера разводят водопроводной водой в соотношении 1:5 (1:8) до содержания аминного азота 120 мг%, добавляют 0,5% хлорида натрия, 0,1 г гидрофосфата калия, устанавливают рН 7,4...7,6, кипятят 15...20 мин, фильтруют через ватно-марлевый или бумажный фильтр, разливают по емкостям и стерилизуют при 120 °С 20...30 мин.
Агар Хоттингера готовят, добавляя к бульону Хоттингера 2 % агар-агара.
Предприятия биологической промышленности выпускают готовые питательные бульон и агар в виде сухого порошка.
Питательный бульон содержит (г/л): триптический гидролизат кильки - 10,05, хлорид натрия - 4,95. Навеску порошка массой 15 г растворяют в 1 л дистиллированной воды, кипятят 2 мин, фильтруют через бумажный фильтр, разливают по емкостям и стерилизуют в автоклаве при 120 ºС 20 мин (рН 7,3).
Питательный агар содержит (г/л): ферментативный гидролизат кормовых дрожжей - 12,0; агар- 12,5; хлорид натрия - 5,5. Навеску порошка массой 36 г растворяют в 1 л дистиллированной воды, кипятят 3 мин, фильтруют через ватный фильтр, стерилизуют при 120 "С 20 мин (рН 7,3).
Обогащенные среды. Многие виды болезнетворных бактерий плохо растут на общеупотребительных питательных средах, поэтому в основные среды добавляют кровь, сыворотку крови, углеводы и т. д. Такие питательные среды получили название обогащенных.
Сывороточный и кровяной агары: к расплавленному и охлажденному до 45...50°С стерильному питательному агару добавляют 5...10% стерильной дефибринирован-ной крови барана (кролика) или сыворотки крови (лошади, крупного рогатого скота, кролика). Для получения дефибринирован-ной крови у барана кровь берут асептично из яремной вены стерильной иглой в стерильный флакон (или колбочку) со стеклянными (фарфоровыми) бусами или шариками, встряхивают вращательными движениями 15...20 мин, чтобы предотвратить свертывание крови. Фибрин остается на бусах.
Компоненты перемешивают, разливают в чашки Петри, пробирки и оставляют до застывания питательной среды.
Сывороточный и кровяной бульоны готовят аналогичным образом.
Растворы углеводов (глюкоза и др.) стерилизуют текучим паром или фильтрованием и добавляют в количестве 0,5... 1 % к питательной среде.
Специальные среды . Так называют среды, разработанные с учетом специфических ростовых потребностей ряда бактерий. Например, желточная среда Мак-Коя для возбудителя туляремии, среда Терских для культивирования лептоспир и др.
Среда Мак-Коя: чистые куриные яйца обрабатывают спиртом, быстро проводят через пламя горелки. Стерильно вскрывают, желтки отделяют от белков. К 60 частям желтков добавляют 40 частей физиологического раствора (рН 7,0...7,2). Компоненты перемешивают, разливают в пробирки по 4...5 мл и помещают в наклонном положении в аппарат для свертывания сыворотки. Стерилизуют в первый день при 75 °С 1 ч, на второй день при 85 °С 30 мин. Для контроля стерильности приготовленные среды выдерживают 2 сут в термостате при 37...38 °С.
Среда Терских состоит из фосфатной смеси Зеренсе-на и кроличьей сыворотки. Смесь Зеренсена: раствор А: гидрофосфат натрия - 11,876 г, вода дистиллированная - 1000 мл; раствор Б: дигидрофосфат калия - 9,078 г, вода дистиллированная - 1000 мл. К 90 мл раствора А добавляют 10 мл раствора Б и доводят объем дистиллированной водой до 1000 мл. Раствор разливают в пробирки по 5 мл, стерилизуют при 1,5 атм 20 мин. В каждую пробирку добавляют шесть-восемь капель стерильной инактивированной при 56 °С сыворотки кролика.
Элективные среды
(лат. electus - избранный). Это питательные
среды для избирательного выделения и накопления микроорганизмов определенного вида из материалов, содержащих несколько видов микробов. Элективные среды чрезвычайно многообразны по своему составу. В них включают компоненты, обеспечивающие преимущественный рост искомого микроорганизма и
(или) подавляющие в той или иной степени рост сопутствующей
микрофлоры. По консистенции среды данного типа могут быть
плотными и жидкими. Жидкие элективные среды называют средами обогащения или накопления, их применяют, когда ставят
цель увеличить количество искомого микроорганизма в смешанной популяции.
Молочно-солевой агар предназначен для избирательного культивирования стафилококков. К расплавленному МПА с рН 7,2...7,4, содержащему 5...7,5 % хлорида натрия, добавляют 10 % стерильного обезжиренного молока, перемешивают и разливают в чашки Петри.
Среда Шустовой предназначена для выделения сальмонелл. Представляет собой МПА (рН 7,4) с добавлением 10 % к объему среды 50%-го водного раствора тиосульфата натрия и 2 % раствора Люголя.
Среда Раппопорт предназначена для культивирования сальмонелл. К МПБ добавляют 1 % глюкозы, 10 % желчи, 1 % индикатора Андрэдэ. Стерилизуют текучим паром.
Среда Мюллера предназначена для культивирования сальмонелл. В колбу с 4,5 г стерильного мела наливают 90 мл МПБ, стерилизуют в автоклаве при 120 "С 30 мин. Затем стерильно добавляют 2 мл раствора Люголя и 10 мл раствора тиосульфата натрия (тиосульфат натрия - 50 г, дистиллированная вода - 100 мл), стерилизуют в аппарате Коха 30 мин.
Среда Кауфмана - это среда обогащения для сальмонелл. К 100 мл среды Мюллера добавляют 1 мл водного раствора бриллиантового зеленого, разведенного 1: 1000, и 5 мл стерильной бычьей желчи. Смесь стерилизуют текучим паром 30 мин.
Казеиново-угольный агар (КУА) с пенициллином используют для культивирования бордетелл. К 1000 мл дистиллированной воды добавляют гидролизат казеина - 20 мл, хлорид натрия - 5 г, хлорид калия - 0,2 г, хлорид кальция - 0,002 г, карбонат натрия - 0,4 г, хлорид магния - 0,025 г, гидрофосфат калия - 0,24 г, растворимый крахмал - 1 г, цистин - 0,01 г, агар -20 г. Компоненты растворяют, устанавливают рН 7,2, стерилизуют при 0,5 атм 30 мин. Перед употреблением в расплавленный агар (50 °С) добавляют 3 % дрожжевого экстракта и 0,2 % сухого активированного угля и 0,5 ЕД/мл пенициллина. Компоненты перемешивают и разливают по чашкам Петри.
Дифференциально-диагностические среды. Предназначены для выявления ферментов у микроорганизмов. По консистенции могут быть жидкими, полужидкими, плотными. В состав этих сред входят основная питательная среда, обеспечивающая рост изучаемого микроорганизма, субстрат для обнаружения фермента и индикатор, по изменению цвета которого судят о сдвиге рН среды в результате расщепления субстрата.
К питательным средам такого типа относят среды Гисса, Эндо, Плоскирева, Левина и др.
Среды Гисса используют для изучения ферментативных свойств выделенных культур микроорганизмов. К 100 мл дистиллированной воды добавляют 1 % пептона, 0,5 г хлорида натрия. Компоненты растворяют, фильтруют через бумажный фильтр, устанавливают рН 7,0...7,4, добавляют один из углеводов-субстратов (лактоза, глюкоза и т.д.), агар-агар (0,3...0,4 %), а затем 1мл индикатора Андрэдэ или 0,1мл 1,6%-го раствора бромтимолового синего. Готовую среду разливают по 3 мл в пробирки, стерилизуют текучим паром три дня подряд по 30 мин или при 112 °С 20 мин.
Выпускают сухие среды Гисса с индикатором BP - смесь водно-голубого с розоловой кислотой (готовые среды - полужидкой консистенции).
Плотные дифференциально-диагностические среды применяют для первичной изоляции возбудителей из материала. В их состав нередко кроме известного субстрата входят вещества, придающие питательной среде селективные свойства.
Среда Эндо содержит лактозу в качестве субстрата и предназначена для дифференциации бактерий, различающихся по способности расщеплять лактозу.
К 1000 мл расплавленного МПА (рН 7,4) температурой 70 °С добавляют 1 г лактозы, предварительно растворенной в небольшом количестве дистиллированной кипяченой воды. В отдельных пробирках готовят: 2...3 мл спиртового раствора основного фуксина; 10 мл 10%-го водного раствора сульфата натрия.
В стерильную пробирку вносят 1 мл раствора фуксина и добавляют раствор сульфита натрия до обесцвечивания фуксина. Приготовленную смесь вливают в расплавленный агар, перемешивают и разливают по чашкам Петри. Готовая среда бесцветна, при росте на ней микроорганизмов, расщепляющих лактозу, среда закисляется, обесцвеченный фуксин восстанавливается, и колония микроорганизма, например эшерихий, приобретает красный цвет с металлическим оттенком. Среду готовят за сутки до ее использования. Выпускают также сухую среду Эндо. Перед употреблением определенную навеску порошка вносят в дистиллированную воду, кипятят и разливают по чашкам Петри.
Среда Левина аналогична по целевому назначению среде Эндо, но содержит другой индикатор (эозин с метилено-вым синим). К 100 мл расплавленного МПА (рН 7,2...7,4) добавляют 2 мл 0,5%-го водного раствора метиленового синего, 1,5 мл 2%-го раствора эозина желтого, 2 г лактозы, 0,2 г дигидрофосфата калия. Растворы красителей готовят на дистиллированной воде, стерилизуют текучим паром 60 мин. Лактозу и дигидрофос-фат калия предварительно разводят в небольшом количестве стерильной дистиллированной воды и кипятят. Колонии лактозопо-зитивных бактерий на этой среде окрашены в фиолетово-черный цвет.
Агар Плоскирева предназначен для выделения сальмонелл, содержит лактозу в качестве субстрата и компоненты, подавляющие рост сопутствующей микрофлоры. Среду выпускают в виде порошка, в ее состав кроме питательной агаровой основы входят: желчные соли, цитрат натрия, тиосульфат натрия, фосфат натрия, бриллиантовый зеленый, кальцинированная сода, йод, хлорид натрия, лактоза, нейтральный красный. Навеску порошка растворяют в воде, кипятят и разливают в чашки Петри. Готовая среда прозрачная или розоватая. Колонии сальмонелл бесцветные, эшерихий - брусничного цвета.
Методы культивирования микроорганизмов. Наряду с общими принципами культивирование микроорганизмов различных физиологических групп имеет некоторые особенности Культивирование аэробных и факультативно-анаэробных бактерий. Плотные, жидкие или полужидкие питательные среды, засеянные чистыми культурами микроорганизмов или исследуемым материалом, помещают в термостаты (рис. 34), поддерживающие оптимальную для данного микроорганизма температуру. При температурах, превышающих верхнюю границу нормы, бактерии не только замедляют рост, но и быстро гибнут. При температуре ниже оптимальной скорость роста микроорганизма постепенно замедляется.
У мезофилов температурный оптимум находится в интервале 30...37 ºС, у психрофилов - 10... 15 ºС, у термофилов - 50...60 ºС.
Микроорганизмы в процессе культивирования на питательных средах при условии, что в среды не вносят дополнительные вещества, постепенно замедляют и затем прекращают свой рост из-за истощения питательного субстрата, изменения оптимальных значений биофизических показателей (рН, Eh и т.д.). Такое культивирование микроорганизмов называют периодическим. Если при этом жидкую питательную среду в процессе инкубирования посевов не перемешивают, то такой способ культивирования определяют как стационарный. При диагностических бактериологических исследованиях обычно используют именно такой способ культивирования. В биологической промышленности при производстве вакцин и других биопрепаратов, когда необходимо достичь максимального выхода бактериальной массы или экзотоксинов, применяют периодическое культивирование в жидких средах с их интенсивным перемешиванием.
При таких задачах аэробные бактерии культивируют в колбах, бутылях на шюттель-аппаратах с частотой колебания 150... 250 мин-1, что облегчает передачу бактериям кислорода и питательных компонентов.
Рис. 35. Схема ферментера для глубинного культивирования аэробных микроорганизмов.
1 – вход воздуха; 2 – выход воздуха; 3 – отбойники; 4 – мешалка; 5 - барботер
Наиболее эффективное культивирование бактерий в жидких питательных средах с максимальным выходом биопродукта достигают в ферментерах. Ферментеры (реакторы) представляют собой металлические или стеклянные культуральные сосуды емкостью от 500 мл до 1000 л (рис. 35). При культивировании бактерий в ферментерах среду перемешивают специальными мешалками с одновременной подачей необходимого количества стерильного воздуха. Ферментеры конструируют как автономные системы с автоматической регуляцией температуры и рН среды. В ферментерах также осуществляют непрерывное (проточное) культивирование, при котором в отличие от периодической культуры автоматически в среду подаются свежие питательные компоненты со скоростью, равной удалению аналогичного объема выросшей культуры бактерий. Такое непрерывное культивирование в хорошо отрегулированной системе в принципе можно продолжать неограниченно долго.
Культивирование анаэробных бактерий. Облигатные анаэробы - бактерии, у которых энергетический и конструктивный метаболизм происходит без молекулярного кислорода 02. У таких микроорганизмов в процессе дыхания конечными акцепторами
электронов являются окись углерода (IV), ионы сульфата, фумарат и др. Кроме того, молекулярный кислород действует на многие анаэробы губительно. Например, строгие анаэробы погибают при незначительных концентрациях кислорода (бактероиды, фузобак-терии), умеренные анаэробы менее чувствительны (С. perfringens ), аэротолерантные анаэробы могут расти в условиях обычной атмосферы (молочнокислые бактерии). Большинство болезнетворных анаэробов относят к строгим или умеренным анаэробам. Для их культивирования используют специальные питательные среды и газовые смеси. Последними наполняют анаэростаты.
Необходимое условие роста облигатных анаэробов - не столько отсутствие молекулярного кислорода, сколько низкий ОКВП питательных сред. Резко восстановительных условий достигают, добавляя в среды редуцирующие (восстанавливающие) вещества и одновременно удаляя из них молекулярный кислород. В качестве редуцирующих веществ в питательные среды добавляют химические соединения, приведенные в таблице 1.
1. Восстанавливающие вещества для культивирования анаэробов
С этой же целью в питательные среды вносят вареные кусочки печени, мышц, мозга, кровяные сгустки, куриный яичный белок, зерна ржи. Считают, что в этих тканях сильное редуцирующее действие оказывают вещества, богатые SH-группами.
Для создания условий анаэробиоза питательные среды максимально освобождают от кислорода путем кипячения, а также пропуская через жидкие среды инертные газы или наслаивая на поверхность питательной среды вазелиновое масло для предотвращения контакта с кислородом воздуха.
Мясо-пептонный печеночный бульон (МППБ) Китта-Тароцци - традиционная среда для культивирования анаэробов. Ее основой служит печеночная вода, которую готовят путем кипячения в воде мелких кусочков говяжьей печени (соотношение 1:1). Печеночную воду смешивают с МПБ в соотношении 1:2, смесь кипятят, устанавливают необходимый рН и разливают в пробирки по 10 мл. В пробирки добавляют кусочки вареной печени (восстановитель) и затем вносят по 2 мл вазелинового масла. Автоклавируют при 0,5 атм 20 мин. Перед употреблением пробирки со средой кипятят в водяной бане, затем охлаждают и только после этого проводят посев.
Для выращивания анаэробов используют также питательные среды с повышенной вязкостью, поскольку диффузия кислорода в них затруднена.
Полужидкий агар: к МПБ добавляют 0,25...0,75 % агара, 1 % глюкозы, устанавливают рН 7,4, разливают в пробирки высоким столбиком и дробно стерилизуют.
Практикуют культивирование анаэробов в толще плотных сред.
Сахарный агар в трубках Вейона: к 2%-му МПА добавляют 1 % глюкозы, устанавливают рН 7,4. Посевной материал вносят в расплавленную и охлажденную до 48...50 "С среду, перемешивают и разливают по стерильным узким стеклянным трубкам - трубкам Вейона (длина 20...25 см, диаметр 1...1,5 см). Концы трубок закрыты стерильными резиновыми пробками. Колонии анаэробов вырастают в толще питательной среды.
Широко применяют культивирование анаэробов на поверхности плотных питательных сред в чашках Петри.
Из числа плотных сред для культивирования анаэробов довольно часто используют кровяной агар с глюкозой и железо-сульфитный агар.
Глюкозо-кровяной агар: к 3%-му МПА (рН 7,2...7,4), расплавленному и охлажденному до 50°С, добавляют 1...2% стерильного раствора глюкозы, 15...20% дефибриниро-ванной крови барана и разливают по чашкам Петри.
Железо-сульфитный агар (среда Вильсон-Блера): к 100 мл 3%-го МПА (рН 7,4) с 1 % глюкозы при температуре 60 °С добавляют 10 мл 20%-го раствора сульфита натрия и 1мл 8%-го раствора хлорида железа, затем среду разливают по чашкам Петри. Анаэробы при росте на этой среде восстанавливают сульфит натрия до сульфата натрия, который реагирует с хлоридом железа, образуя черный осадок сульфита железа; колонии бактерий окрашены в черный цвет.
Для культивирования анаэробов на поверхности плотных питательных сред недостаточно добавления в них восстанавливающих агентов. Культуральные сосуды с посевами помещают в герметические камеры (анаэростаты), в которых тем или иным способом создают анаэробные (бескислородные) условия.
Обычный анаэростат представляет собой металлический цилиндр, который герметически закрывает крышка с резиновой прокладкой (рис. 36). На крышке размещены манометр и краны для откачивания воздуха или наполнения анаэростата инертным газом (азот). Воздух откачивают с помощью вакуумного насоса, закручивают вентиль и анаэростат с пробирками или чашками помещают в термостат. Обычное остаточное давление в анаэро-стате около 10 мм рт. ст. Созданы анаэростаты, удаление кислорода из которых происходит за счет его реакции с водородом в
присутствии катализатора (платиновый, палладиевый). Водород в камеру закачивают из баллона через редуктор. Некоторые анаэробные камеры снабжены нагревательными элементами с терморегулирующим устройством, обеспечивающим автономное поддержание температуры на необходимом уровне.
Культивирование микроаэрофильных бактерий. Хотя микроаэрофильные бактерии по типу дыхания аэробы, они растут не в обычной атмосфере (21 % кислорода), а с пониженным содержанием кислорода. Например, Campylobacter fetus растет в атмосфере, содержащей не более 6 % кислорода. Такую атмосферу можно создать в герметичных термостатах, анаэростатах, заменяя часть воздуха сжатым оксидом углерода (IV) из баллона, или в обычном эксикаторе. В последнем случае пробирки с посевами помещают в эксикатор вместе с бюксом, содержащим ватку, смоченную спиртом, или свечу. Вату (свечу) зажигают и закрывают крышку эксикатора. Пламя затухает по мере выгорания кислорода, и снижение его содержания достаточно для роста микроаэрофилов.
Наиболее доступен и эффективен способ культивирования микроаэрофилов в полужидкой среде с 0,1...0,4 % агара. В такой среде конвекционные потоки не способны перемешивать верхние, богатые кислородом слои среды с нижними, что создает в среде, заполняющей пробирку, градиент концентрации кислорода. Культуру микроаэрофила засевают уколом, и микроорганизм растет в зоне с оптимальным содержанием кислорода, обычно в виде тонких дисков на расстоянии от нескольких миллиметров до нескольких десятков миллиметров от поверхности среды.
Культивирование грибов. Лучший рост грибов отмечен на средах с содержанием углеводов 1...4%. При первичной изоляции для подавления роста различных сопутствующих бактерий в питательные среды часто добавляют антибиотики.
Агар Сабуро применяют для культивирования возбудителей дерматомикозов и кандидамикоза. Глюкоза -4 г, пептон - 1 г, агар - 1,8 г, дистиллированная вода - 100 мл. После растворения агара среду фильтруют, разливают по пробиркам и стерилизуют при 0,5 атм 30 мин. После стерилизации рН среды 6,9...7,0.
Агар Чапека используют для культивирования грибов многих видов. Глюкоза - 30 г, нитрат натрия - 2 г, дигидрофосфат калия - 1, сульфат магния - 0,5 г, хлорид калия - 0,5 г, сульфат железа -0,0012 г, агар -20 г, дистиллированная вода - 1000 мл. Естественный рН среды 5,6...5,9. Среду стерилизуют при 0,5 атм 30 мин.
Сусло-агар предназначен для культивирования возбудителей дерматомикозов и кандидамикоза. Солодовое неохме-ленное сусло разбавляют водопроводной водой в соотношении 1: 2 (до содержания Сахаров 7 %), устанавливают рН 6,5...6,7, добавляют 2 % агара, кипятят, фильтруют, стерилизуют при 0,5 атм 30 мин.
Агар Литмана пригоден для культивирования дерматофитов. Пептон - 10 г, глюкоза - 10 г, бычья желчь - 15 г, кристаллвиолет -0,01 г, агар -20 г, дистиллированная вода- 1000 мл. Среду стерилизуют при 1 атм 15 мин.
Среда Ван-Итерсона предназначена для выделения из кормов токсичных грибов, вызывающих стахиботриотоксикоз, дендродохиотоксикоз и др. Нитрат аммония - 0,5 г, дигидрофосфат калия - 0,5 г, водопроводная вода - 1000 мл. Среду стерилизуют при 1 атм 30 миц. Затем средой увлажняют стерильные чашки Петри с фильтровальной бумагой.
Жидкая среда Чапека. Глюкоза - 30г, нитрат натрия - 2 г, дигидрофосфат калия - 1 г, сульфат магния - 0,5 г, хлорид калия -0,5 г, сульфат железа - 0,001 г, дистиллированная вода - 1000 мл. Среду стерилизуют при 0,5 атм 30 мин. После стерилизации рН среды 5,9...6,2. Жидкую среду можно использовать для увлажнения фильтровальной бумаги в чашках Петри с целью последующего культивирования грибов.
Среда Билай предназначена для получения макроконидий грибов. Нитрат калия - 2 г, дигидрофосфат калия - 1 г, сульфат магния -0,5 г, хлорид калия -0,5 г, сульфат железа - следы, крахмал растворимый - 0,1 г, сахароза - 0,1 г, глюкоза - 0,1 г, дистиллированная вода - 1000 мл. Среду разливают по пробиркам по 5 мл и в каждую пробирку вставляют полоску фильтровальной бумаги таким образом, чтобы большая часть ее находилась над раствором. Среду стерилизуют при 1 атм 20 мин.
Глюкозный бульон Сабуро используют для культивирования грибов многих видов. Глюкоза - 40 г, пептон - Юг, дистиллированная вода- 1000мл. Нагревают до кипения, разливают по пробиркам и стерилизуют при 1 атм 15 мин.
Культивирование на волосах по Ван-брейзегему применяют при выделении дерматофитов. Здоровые стерильные волосы прикрепляют коллодием к стеклянной трубочке. На середину волос наносят культуру гриба. Трубочку помещают в цилиндр, на дно которого для влажности наливают небольшое количество воды. Культивируют при 25 "С пять-десять дней и более.
Для выделения возбудителей гистоплазмоза, эпизоотического лимфангита применяют кровяной агар.
ЗАДАНИЯ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ
1. Приготовить скошенный МПА, сывороточный и кровяной
МПА.
2. Изучить устройство анаэростата и ферментера.
Контрольные вопросы
1.Какие общие требования предъявляют к питательным средам?
2.На какие группы классифицируют питательные среды?
Как культивируют анаэробы и микроаэрофилы
Питательные среды являются основой бактериологических исследований. Они служат для выделения из исследуемого материала чистых культур микробов, для изучения их свойств. На питательных средах создаются оптимальные условия для размножения микроорганизмов. В состав сред должны входить вещества, необходимые для построения всех компонентов цитоплазмы, т.е. все источники роста живого организма. Сюда, в первую очередь, относятся источники азота, углерода, водорода и кислорода.
Источник водорода и кислорода в питательных средах - вода. Источником азота служат органические соединения, которые получают из мяса, рыбы, плаценты, молока, яиц, крови. В результате гидролиза панкреатином или трипсином из этих продуктов получаются т.н. гидролизаты, содержащие большое количество аминокислот и пептонов, которые хорошо усваиваются большинством микроорганизмов. Нативный белок усваивают только некоторые микроорганизмы, имеющие экзопротеазы. Гидролизаты являются основой для приготовления сред для многих микроорганизмов.
Источником углерода для патогенных микробов являются, главным образом, различные углеводы: моно- и дисахара, многоатомные спирты, органические кислоты и их соли.
Кроме органогенов, бактериям необходимы неорганические соединения, содержащие фосфор, калий, серу, натрий, магний, железо, а также микроэлементы: кобальт, йод, марганец, бор, цинк, молибден, медь и др.
Потребность микроорганизмов в неорганических соединениях удовлетворяется прибавлением к питательной среде солей КН2РO4 К2НРO4 и др. Микроэлементы, выполняющие роль катализаторов химических процессов, необходимы в ничтожно малых количествах и поступают в питательную среду с пептоном, неорганическими солями и водой. Наряду с перечисленными органическими элементами, многие микроорганизмы нуждаются в факторах роста, т.е. в веществах, которые они сами не могут синтезировать. Факторы роста необходимо добавлять в питательные среды в готовом виде. К факторам роста относятся различные витамины, источником которых в питательных средах являются прибавленные к питательной среде продукты растительного и животного происхождения, содержащие в своем составе никотиновую, пантотеновую, парабензойную кислоты, витамины А, В, С и др.
Питательные вещества микробами могут усваиваться только при определенной реакции среды, т.к. проницаемость оболочек микробных клеток изменяется в зависимости от рН среды.
Требования, предъявляемые к питательным средам.
1. Питательные среды должны содержать необходимые для питания микробов питательные вещества.
2. Иметь реакцию рН, оптимальную для выращиваемого вида микроба. -
3. Питательные среды должны иметь достаточную влажность и вязкость, т.к. микробы питаются по законам диффузии и осмоса.
4. Обладать изотоничностью и иметь определенный окислительно-восстановительный потенциал (гН2).
5. Питательные среды должны быть стерильными, обеспечивая тем самым возможность выращивания чистых культур.
Потребность в питательных веществах и физических условиях у различных видов микробов неодинакова, и этим исключается возможность создания универсальной питательной среды.
По консистенции различают плотные и жидкие питательные среды. Плотные готовят на основе жидких посредством прибавления к ним клеевых веществ: агар-агара или желатина! Агар-агар (по-малайски - желе) - продукт растительного происхождения, добывается из морских водорослей. В воде агар-агар растворяется при температуре 80-86°С, затвердевает при 36-40 , и поэтому используется для уплотнения питательных сред для выращивания разных групп микроорганизмов при оптимальной для них температуре.
Классификация питательных сред производится по их составу и назначению
1.По составу питательные среды делятся на простые и сложные
Различают группу сред общего назначения - простых. К этой группе относят мясо-пептонный бульон (простой питательный бульон), мясо-пептонный агар {простой питательный агар), питательный желатин. Эти среды применяются для выращивания многих патогенных микробов. Среды общего назначения, или простые питательные среды, готовятся обычно из гидролизатов с добавлением пептона и хлористого натрия. Их используют также как основу для приготовления сложных сред.
2.Ко второй группе относятся среды элективные, специальные и дифференциально-диагностические.
Среды элективные (селективные, избирательные, накопления, обогащения). Принцип создания элективных питательных сред основан на удовлетворении основных биохимических и энергетических потребностей того вида микроба, для культивирования которого они предназначены, или на добавление ингибиторов, подавляющих рост сопутствующей микрофлоры. Определенный состав и концентрация питательных веществ, микроэлементов, ростовых факторов при строго определённом значении pH или добавлении ингибиторов обеспечивают оптимальные условия для выращивания одного или нескольких видов микроорганизмов. При посеве на них материала, содержащего смесь различных микробов, раньше всего будет провялятся рост того вида, для которого среда будет элективной. Примером элективных сред являются желточный бульон, селенитовый бульон, среда Плоскирева – для выращивания микробов семейства кишечных, щелочная пептонная вода – для холерного вибриона.
Желточный бульон. К МПБ добавляют 10-20% бычьей желчи. Желчь подавляет рост коков и воздушной флоры, но благоприятна для размножения сальмонелл.
Селенитовый бульон. Состоит из фосфатного бульона с добавлением натриевой соли селенита, которая является ингибитором роста кокковой флоры, кишечной палочки, но не задерживает роста сальмонелл.
Среда Плоскирева. Плотная среда, содержащая ингибиторы кишечной палочки, коков, но благоприятная для роста шигелл и сальмонелл, размножение которых не тормозится бриллиантовым зелёным и желчными солями.
Пептонная вода. Содержит 1% пептона и 0,5% хлористого натрия. Среда является элективной для хлорных вибрионов, т.к. они лучше других бактерий размножаются на “голодных средах”, особенно при щелочной реакции, потому что сами выделяют кислые продукты жизнедеятельности.
Специальные среды. Необходимы для культивирования бактерий, не растущих на простых питательных средах. Для некоторых организмов к простым питательным средам необходимо добавлять углеводы, кровь и др. дополнительные питательные вещества. Примерами простых питательных сред являются сахарный бульон и сахарный агар для стрептококка (готовится соответственно из МПБ и МПА, к которым добавляется 0,5-2% глюкозы).
Для пневмококков и менингококков специальной средой являются сывороточный бульон и сывороточный агар (для приготовления сывороточного бульона смешивают 1 часть МПБ с 2 частями свежей сыворотки, для получения, сывороточного агара к расплавленному МПА добавляется 10-25% стерильной лошадиной или бычьей сыворотки).
Дифференциально-диагностические среды используют для определения видовой принадлежности исследуемого микроба, основываясь на особенностях его обмена веществ». По своему назначению дифференциально-диагностические среды разделяют следующим образом:
1. Среды для выявления протеолитической способности микробов, содержащие в своем составе молоко, желатин, кровь и т.д.
2. Среды с углеводами и многоатомными спиртами для
обнаружения различных сахаролитических ферментов.
В состав дифференциально-диагностических сред, предназначенных для выявления сахаролитических свойств и окислительно-восстановительных ферментов, вводят индикаторы: нейтральную красную, кислый фуксин, бромтимоловый синий, водный голубой с розовой кислотой (ВР). Изменяя свою окраску при различных значениях рН, индикатор указывает на наличие фермента и расщепление введённого в среду ингредиента.
Примеры дифференциально-диагностических сред:
Среда Эндо. Состоит из МПА с добавлением 1% лактозы и обесцвеченного сульфитом натрия основного фуксина (индикатор). Среда Эндо имеет слаборозовый цвет. Используется в диагностике кишечных инфекций для дифференциации бактерий, разлагающих лактозу с образованием кислых продуктов, от бактерий, не обладающих этой способностью. Колонии лактозонозитивных микробов (кишечная палочка) имеют красный цвет вследствие восстановления фуксина. Колонии лактозонегативных микроорганизмов - сальмонелл, шигелл и др. -бесцветны.
К дифференциально-диагностическим средам относятся короткий и развёрнутый пёстрый ряд. Он состоит из сред с углеводами (среды Гисса), МПБ, молока, мясопептонной желатины.
Среды Гисса готовятся на основе пептонной воды, к которой прибавляются химически чистые моно-, ди- или полисахариды (глюкоза, лактоза, крахмал и др.).
Для обнаружения сдвигов рН в результате образования кислот и разложения углевода в среды прибавляют индикатор. При более глубоком расщеплении углеводов образуются газообразные продукты (СО2, СН4 и др.), которые улавливаются при помощи поплавков - маленьких пробирочек, опущенных в среду кверху дном. Среды с углеводами могут готовиться и плотными – с добавлением 0,5-1% агар-агара. Тогда газообразование улавливается по образованию пузырьков (разрывов) в столбике среды.
На МПБ, входящем в пёстрый ряд, обнаруживают продукты, образующиеся при расщеплении аминокислот и пептонов (индол, сероводород). Сероводород обнаруживается путем помещения в МПБ после засева культуры полоски фильтровальной бумаги, пропитанной раствором уксуснокислого свинца. При расщеплении аминокислот, содержащих серу, выделяется сероводород, бумажка чернеет за счёт образования сернистого свинца. Для определения индола можно использовать сложный индикатор. Индол образуется при расщеплении триптофана, и его можно обнаружить при добавлении к культуре, выращенной на МПБ, этого индикатора. При наличии индола МПБ окрашивается в зеленый или синий цвет.
Сухие среды.
Питательный агар, а также основные дифференциально-диагностические среды выпускаются в настоящее время в виде сухих препаратов, содержащих все необходимые составные части. К таким порошкам нужно добавить только воду и сварить, а затем, после разливки, простерилизовать.
Классификация питательных сред:
Натуральные – состоят из продуктов животного или растительного происхождения и имеют неопределенный химический состав. Например: овощные и фруктовые соки, животные ткани, кровь, молоко, яйца и т.д. (МПА, МПБ).
Полусинтетические – в состав входят соединения известной химической природы и вещества неопределенного состава. Например: МПБ с глюкозой, среда Эндо, среда Сабуро.
Синтетические – содержат только химически чистые соединения в точных концентрациях. Применяют в лабораторных экспериментах. Например: среда Чапека, Омелянского, Ушинского и т.д.
Назначение питательных сред
Универсальные (общего назначения)- пригодны для выращивания многих видов микроорганизмов и применяются как основа для специальных питательных сред. Примеры: МПБ, МПА, среда Хоттингера, ГРМ, тиогликолевая среда.
Специальные применяют в тех случаях, когда микроорганизмы не растут на простых средах. К ним принадлежит кровяной, сывороточный агар, сывороточный бульон, асцитический бульон, асцит-агар и другие.
1. Элективные среды - на них одни микроорганизмы растут быстрее и более интенсивно, чем другие виды бактерий. Например, 1 % щелочная пептонная вода является элективной средой для холерных вибрионов, среды Ру и Леффлера – для возбудителей дифтерии.
2. Селективные - благодаря селективным добавкам (желчь, краски, антибиотики и др.) способны подавлять развитие одних видов микроорганизмов, но не влияют на другие виды. Примеры: среда Мюллера является селективной для тифо-паратифозных бактерий, фуразолидоно-твиновий агар – для коринебактерий и микрококков. Добавление антибиотиков в состав сред делает их селективными для грибов (напр. среда Сабуро и др.).
3. Дифференциально-диагностические - группа сред, которые позволяют определить биохимические свойства микроорганизмов и провести их дифференциацию. Они разделяются на среды для определения протеолитических, пептолитических, сахаролитических, гемолитических, липолитических, редуцирующих свойств (среды Эндо, Левина, Плоскирева, Гисса).
4. Консервирующие (траспортные)-
предназначены для сохранения жизнеспособности микроорганизмов от момента взятия
биоматериала до посева для диагностики
Жидкие (бульоны) – изучение физиолого-биохимических особенностей и накопление биомассы микроорганизмов
Полужидкие (1% агара) – хранение культур и культивирование анаэробов
Плотные (3-5% агара)– выделение чистых культур, накопление, количественный учет, изучение культуральных свойств, антагонистические взаимоотношения
Сыпучие – хранение посевного материала в промышленности (пшено, отруби)
Сухие – выпускаются промышленностью для приготовления питательных сред
Транспортная система со средой Стюарта
Среда Стюарта представляет собой полужидкий, бедный питательными веществами субстрат для сохранения и транспортировки широкого спектра патогенных микроорганизмов, таких, как Neisseria gonorrhoeae, Haemophilus influenzae, Corynebacterium diphteriae, Trichomonas vaginalis, Streptococcus sp., Salmonella sp., Shigella sp. и др. Наиболее требовательные микроорганизмы сохраняются в данной среде более суток, прочие – до нескольких дней.
Наличие в среде тиогликолата подавляет ферментативную активность бактерий, а отсутствие азота предотвращает их размножение.
Транспортная система со средой Кери Блэйр
Транспортная среда Кери Блейр представляет собой модификацию базовой транспортной среды Стюарта, предназначенную специально для фекальных образцов.
Глицерофосфат, являющийся метаболитом некоторых энтеробактерий (Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, и др.), заменен неорганическим фосфатом,
удален метиленовый синий и рН среды увеличена до 8,4.
Среда Кери Блейр позволяет сохранять большинство патогенов, включая требовательные микроорганизмы, такие как Neisseria sp., Haemophilus sp., Streptococcus sp .
Данная среда является стандартной для транспортировки анаэробов.
Транспортная система со средой Эймса
Транспортная среда Эймса представляет собой очередную модификацию базовой транспортной среды Стюарта, в которой глицерофосфат заменен неорганическим фосфатом, поскольку глицерофосфат является метаболитом некоторых энтеробактерий (Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, ets .) и может поддерживать рост некоторых грамотрицательных микроорганизмов.
Метиленовый синий заменен на активированный уголь фармацевтического качества.
В среду добавлены кальций и магний для поддержания проницаемости бактериальных клеток.
Эта среда способна более 3 дней поддерживать такие микроорганизмы, как Neisseria sp., Haemophilus sp., Corynebacteria, Streptococci, Enterobacteriaceae и др., однако наилучшие результаты дает культивирование в течение первых 24 часов.
Универсальные накопительные среды: Мясопептонный агар (МПА) и мясопептонный бульон (МПБ)
Являются основными средами для посевов микроорганизмов, для проверки чистоты культур перед биохимическим и серотипированием.
Их используют для культивирования и подсчета неприхотливых микроорганизмов. В полужидком виде среда может быть использована для хранения контрольных (эталонных) микроорганизмов.
Универсальные накопительные среды Среда Хоттингера
Предназначен для культивирования различных микроорганизмов, таких как энтеробактерии, синегнойная палочка, стафилококки, некоторые виды стрептококков. При необходимости может быть обогащен углеводами, солями.
Содержит гидролизат Хоттингера, который получают путём ферментативного гидролиза мясного фарша (говяжьего) панкреатином с последующим фильтрованием и добавлением хлороформа в качестве консерванта.
Универсальные накопительные среды: Среда Мюллера-Хинтона
Эту среду используют для культивирования Neisseria sp. и для определения чувствительности микроорганизмов к антимикробным средствам.
Среда МакКонки
Среды МакКонки в качестве дифференциальных рекомендуют для селективного выделения энтеробактерий и близких к ним грамотрицательных палочек.
Лактозоположительные штаммы растут с образованием розовых или красных колоний, которые могут быть окружены зоной преципитации желчных солей.
Красный цвет появляется в результате закисления среды продуктами разложения лактозы (при падении рН ниже 6,8) и адсорбции нейтрального красного.
Штаммы, не ферментирующие лактозу (шигеллы, сальмонеллы), обычно образуют прозрачные бесцветные колонии и не изменяют среду.
Дифференциально-диагностические среды: Среда Эндо
Эта среда разработана Endo как культуральная среда для дифференциации микроорганизмов, ферментирующих и неферментирующих лактозу. Она используется для микробиологического исследования воды, стоков, молочных и других пищевых продуктов.
Сульфит натрия и основной фуксин обладают подавляющим эффектом на грамположительные микроорганизмы. Лактоза разлагается микроорганизмами до альдегида и кислоты. Альдегид в свою очередь освобождает фуксин из фуксин-сульфитного комплекса, усиливая красное окрашивание колоний. У кишечных палочек эта реакция очень выражена и сопровождается кристаллизацией фуксина, что проявляется зеленоватым металлическим блеском (фуксиновый глянец) колоний.
Дифференциально-диагностические среды: Желточно-солевой агар
Эту среду используют в качестве селективной для выделения клинически значимых культур стафилококков.
Маннит является ферментируемым и дифференцирующим субстратом, а также источником углерода.
Добавление (до 5% об/об) эмульсии яичного желтка дает возможность определить липазную активность микроорганизмов. Эмульсия в солевой среде становится прозрачной, поэтому при наличии липазной активности вокруг колоний формируется желтая непрозрачная зона.
Дифференциально-диагностические среды: Вильсона-Блера или Висмут-сульфитный агар
Селективная среда для выделения сальмонелл.
Пептический перевар животной ткани и мясной экстракт служат источником азотистых питательных веществ, углерода, серы, витаминов группы В и микроэлементов, необходимых для роста указанных бактерий.
Бриллиантовый зеленый подавляет рост всех грамположительных бактерий. Глюкоза является ферментируемым углеводом. Сульфат железа позволяет выявить продукцию сероводорода.
Висмут является тяжелым металлом, который подавляет рост большинства грамотрицательных кишечных бактерий, кроме сальмонелл.
Сальмонеллы восстанавливают сульфат железа в присутствии глюкозы и сульфита висмута до сульфида железа, который окрашивает их колонии в черный цвет.
Специальные элективные среды: Среда Леффлера
Эту среду с добавлением лошадиной сыворотки используют для культивирования Corynebacterium diphtheriae из клинического материала и пересевов чистых культур этих микроорганизмов.
Высокая концентрация сыворотки помогает определить протеолитическую активность микроорганизмов, а также пигментообразование. Пептон и мясной экстракт обеспечивают микроорганизмы важнейшими питательными веществами. Глюкоза является ферментируемым субстратом и источником энергии.
Специальные селективные среды: Кампилобакагар
Селективная среду для кампилобактерий которая состояла из основы кровяного агара с бараньей кровью или лошадиной кровью и антибиотиками.
Антимикробные компоненты, существенно подавляют рост нормальной микрофлоры, способствуя росту и выделению из испражнений Campylobacter fetus ssp. jejuni .
Присутствие амфотерицина В в добавке существенно или полностью подавляет рост грибов, введенный позже цефалотин усиливает подавление нормальной кишечной микрофлоры.
Колонии Campylobacter fetus ssp. jejuni имеют слизистый характер, плоские серые с неправильными очертаниями или приподнятые, округлые, без гемолиза.
Некоторые штаммы могут образовывать желто-коричневые или розоватые колонии.
На влажной поверхности среды может наблюдаться слияние роста или роение
Элективные среды были введены в микробиологическую практику С.Н.Виноградским и М.Бейеринком. Это такие питательные среды, в которых путем добавления одного или нескольких химических соединений, создаются оптимальные условия для роста и размножения одного вида микроорганизмов (или группы родственных микроорганизмов) и неблагоприятные – для всех остальных. Такие среды применяются главным образом для выделения чистой культуры микроорганизмов из мест их естественного обитания и для накопления массы культур (химический метод выделения чистой культуры). Например, питательная среда, которая представляет собой свернутую лошадиную сыворотку, является элективной средой для дифтерийных бактерий, щелочная пептонная вода – для холерных вибрионов, желчный бульон – для возбудителя брюшного тифа, печеночный бульон – для бруцелл и т.д.
Накопление микробов а элективных питательных средах во многих случаях служит важным предварительным этапом при выделении чистых культур из исходных исследуемых материалов (например, холерного вибриона или брюшнотифозных бактерий из испражнений больных или носителей и пр.).
Что Вы понимаете под дифиринцально-питательными средами?
Дифференциально – диагностические среды – это такие среды, в состав которых кроме веществ, обеспечивающих рост и развитие микроорганизмов, входят вещества, применяющиеся в качестве субстрата для определенных ферментов. По качественному изменению субстрата Определяется присутствие того или иного фермента (оценивается при помощи индикатора, реагирующего на наличие в питательной среде продуктов распада субстрата).
Каждый вид микроорганизмов характеризуется достаточно стабильным набором ферментов. Определение набора ферментов при помощи дифференциально – дагностических сред позволяет дифференцировать виды микроорганизмов. Например, кровяной агар позволяет выявить фермент гемолизин, среды Гиса – сахаролитические ферменты (карбогидразы), желатин используется для учета протеолитических свойств микробов и т.д.
Кровяной агар. О наличии фермента гемолизина судят по разрушению эритроцитов и образованию светлой зоны вокруг микробов, выросших на кровяном агаре.
Среды Гиса. О наличии ферментов – карбогидраз, расщепляющих углеводы до кислоты, свидетельствует изменение рН среды в кислую сторону и изменение цвета питательной среды. Различие в наборе ферментов может быть использовано для проверки чистоты выделяемой культуры, а также для быстрой дифференцировки одного вида от других при первичном исследовании посевов заразного материала.
Химические реактивы
1. Что такое химические реактивы и для чего они применяются?
Реактивы химические - вещества, используемые в лабораторной практике для осуществления различных химических реакций.
В большинстве случаев химические реактивы являются индивидуальными веществами, однако довольно часто они имеют сложный состав. Общепринятой классификации химических реактивов не существует, чаще всего их делят на аналитические химические реактивы все прочее.
2. В ветеринарии, для каких целей они используются?
B ветеринарии химические реактивы используются для аналитических и диагностических целей в клинических, ветеринарно- санитарных, гигиенических, экспертизных, биохимических и др. лабораторных исследованиях. Методы исследований применяемые и разрабатываемые биологической и клинической практике, требуют большого ассортимента химических реактивов которые должны удовлетворять самым разнообразным требованиям. Например, для клинических и биохимических исследований необходимы высокоочищенные субстраты для ферментов, сами ферменты, реагенты на специфические группы (SH, NH3, СООН - группы и др.) и т.д. Для проведения неорганических и органических синтезов, а также при качественном и количественном анализах, в т:ч. при ветеринарно-санитарном контроле в различных производствах, анализе) лекарственных средств, при проведении ветеринарных, санитарно-гигиенических анализов пищевых продуктов, воздуха, воды и т.д., используют большое число самых разнообразных химических реактивов высокой степени очистки.